Zwf Mutant Escherichia Coli Df214 Suşunun Synechococcus Sp. Pcc 7942 Zwf Fragmentleriyle Genetik Komplementasyonu Üzerine Araştırmalar

Abstract

rv ÖZET zwfMUTANT ESCHERICHIA C0Z7DF214 SUSUNUN SYNECHOCOCCUS SP. PCC 7942 zwfFRAGMENTLERiYLE GENETİK KOMPLEMENTAS YONU ÜZERİNE ARAŞTIRMALAR Bu araştırmada Synechococcus sp. PCC 7942 zwf fragmentleri kullanılarak zwf mutant E. coli DF214 suşunun komplementasyonunun gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Araştırmanın gerekçesi Synechococcus sp. PCC 7942 zwf geninin mutasyonal analizleri için etkili bir konak sistemi oluşturmaktır. 2.9 kb Synechococcus sp. PCC 7942 zwf fragmenti taşıyan pNUT1 rekombinant vektörü ile zwf mutant E. coli DF214 ve yabani tip E. coli JM109 hücreleri transforme edildi. Plazmitin kodladığı ampisilin direncinin takibi ve restriksiyon fragment analizleriyle transformasyonun doğru bir şekilde gerçekleştiği belirlendi. Transformant DF214 (SZD29) hücrelerinde yapılan analizlerde glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PDH) aktivitesine rastlanmadı. Yine transformant JM109 (SZJ29) hücrelerinde yapılan aktivete analizlerinde de yabani tip aktivitenin üzerinde ilave bir G6PDH aktivitesine rastlanmadı. Sonuçta Synechococcus sp. PCC7942 zwf geninin E. coli içinde ekspresyonunun gerçekleşemediğine karar verildi. Çalışmalar Synechococcus sp. PCC7942 zwf fragmentinin füzyon proteini şeklinde lac operonunun bir parçası olarak ekspresyonuna yöneltildi. Bunu gerçekleştirmek için zwf geninin başlangıç ve bitiş bölgeleriyle homolog olan ve geni lacZ' geninin okuma satırında tutacak bir fragment oluşturacak iki PCR primeri tasarlandı. Bu primerler kullanılarak 1.6 kilobazlık bir fragment şeklinde tam bir Synechococcus sp. PCC 7942 zwf geni PCR amplifikasyonu ile üretildi. Bu araştırmamn devamı olarak 1.6 kb zwf fragmentinin doğru pozisyonda pUC18 lacZ' içinde füzyon proteini olarak ekspresyonu gerçekleştirilebilir. Ayrıca fragment güçlü bir ekspreyon vektörü içinde büyük ölçekte üretilerek komplementasyon sağlanabilir. Anahtar Kelimeler: Synechococcus, zwf glukoz-6-fosfat dehidrojenaz, genetik komplementasyonABSTRACT INVESTGATIONS ON THE GENETIC COMPLEMETATION OF THE zwf MUTANT ESCHERICHIA COU STRAIN DF214 WITH THE zwf FRAGMENTS OF SYNECHOCOCCUS SP. PCC 7942 In this study, it was aimed to achieve the complementation of the zwf mutant E. coli strain DF214 using the zw/fragments of Synechococcus sp. PCC 7942. The objective of the study was to produce a versatile host system for mutation analyses of the Synechococcus sp. PCC7942 zwf gens. zwf mutant E. coli strain DF214 and wildtype strain JM109 cells were transformed with a recombinant vector pNUTl carrying 2.9 kb Synechococcus sp. PCC 7942 zw/fragment. Occurance of correct transformation was decided by ampicillin resistance conferred by the pNUTl, and by means of restriction fragment analysis. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) assays of the transformant DF214 (SZD29) cells showed that no enzyme activity was gained. Also assays conducted on the transformant JM109 (SZJ29) cells indicated no additional G6PDH activity over the wildtype activity. Eventually, it was concluded that the expression of the Synechococcus sp. PCC 7942 zwf gene was not occurred in E. coli cells. Studies were oriented to the expression of the Synechococcus sp. PCC 7942 zwf gene as fussion protein integrating an entire zwf gene into a structural gene of the E. coli lac operon. To do this, specific PCR primers which are homologous to the start and the end of the zwf gene were designed, keeping the gene in correct reading frame of lacZ' gene of pUC18. An entire Synechococcus sp. PCC7942 zwf gene as a 1.6 kb fragment was produced by means of PCR amplification. For further work, the 1.6 kb zwf fragment can be expressed ligating into the correct position of the lacZ' gene of pUC18. Additionally, the fragment can be ligated into a powerful expression vector, producing large scale Zwf polipeptide resulting the complementation to be achieved. Key words: Synechococcus, zwf glucose-6-phosphate dehydrogenase, genetic complementation